Desktop Tower Defense spilles på et kart som ligner et kontorbord. Spilleren må stoppe et gitt antall fiender, kjent i sjangeren som "creeps", fra å nå et gitt punkt på spillefeltet. Dette oppnås ved å bygge og oppgradere tårn som skyter på, skader og dreper fiendtlige "creeps" før de klarer å nå målet sitt. I motsetning til mange andre tårnforsvarsspill, er ikke veien til "creepsene" selv fastsatt; i stedet bestemmer tårnene som bygges veien for "creepsene", som tar den korteste veien de kan finne til utgangen. Spillet lar ikke spilleren gjøre en utgang fullstendig utilgjengelig, men sentrale strategier dreier seg om å guide "creeps" inn i lange, kronglete korridorer.